Analisi dei meccanismi molecolari responsabili dell’osteogenesi imperfetta di tipo XIV causata da mutazioni in TMEM38B

L'osteogenesi imperfetta (OI) di tipo XIV è una malattia scheletrica recessiva caratterizzata da fragilità ossea e fratture multiple, senza coinvolgimento di altri organi. Mutazioni in omozigosi nel gene TMEM38B che codifica per un canale del potassio (TRIC-B) sono responsabili della malattia. TRIC-B è presente nella membrana del reticolo endoplasmatico (RE) delle cellule non eccitabili e permette agli ioni potassio di passare dal citosol al RE, agendo così da scambiatore di cariche positive necessario per l'uscita degli ioni calcio dal RE senza alterare il potenziale di membrana. L'omeostasi del calcio è molto importante per la funzionalità cellulare. L'esatto meccanismo molecolare che collega la perdita della funzione di TRIC-B al fenotipo scheletrico dell'OI XIV è ancora sconosciuto. L'obiettivo della nostra ricerca sarà quello di sviluppare e utilizzare modelli in vitro ed in vivo per verificare l'ipotesi che una anormale proliferazione e differenziamento degli osteoblasti, causata da alterata concentrazione intracellulare di calcio, potrebbe causare la fragilità ossea nell'OI XIV. Utilizzando la nuova metodica di ingegneria genica CRISPR /Cas9 il gene TMEM38B sarà eliminato in una linea immortalizzata di osteoblasti umani ampiamente usata come modello per l'indagine dell'osteoblastogenesi. Proliferazione e differenziamento saranno valutati in cellule controllo e mutate. Per confermare i dati ottenuti in vitro prevediamo di generare un modello di zebrafish per l'OI XIV utilizzando la tecnologia CRISPR /Cas9 per distruggere il gene tmem38b in vivo. Il successo del targeting genico verrà convalidato a livello di DNA e di proteina ed il fenotipo osseo degli zebrafish mutanti verrà analizzato. In caso di successo il progetto permetterà l'identificazione di alcuni meccanismi molecolari responsabili dell'OI di tipo XIV e fornirà utili strumenti in vitro e in vivo per approfondire ulteriormente le indagini delle vie metaboliche compromesse in questa malattia